本发明公开了一种D?缬氨酸取代去甲斑蝥素衍生物及其制备方法与应用，其特征在于：用1, 3?偶极环加成方法在D?缬氨酸取代去甲斑蝥素结构中C5和C6位引入吡唑环，与色酮衍生物反应导入色酮结构，合成含有色酮结构的吡唑类D?缬氨酸取代去甲斑蝥素衍生物，该衍生物对于肿瘤细胞株具有良好的抑制作用，其中对于人肝癌细胞具有更好的抑制率和选择性，在制备抗肿瘤药物等方面，具有非常好的工业应用前景。